هیبریداسیون سلول سوماتیکی :                                               

هیبریداسیون سلول سوماتیکی که لقاح سلول سوماتیکی یا لقاح پروتوپلاست نامیده می شود دلالت براتحاد پروتوپلاست گیاهی سلولهای سوماتیک گونه های مختلف ومتعاقباً باززایی گیاهان هیبریدحاصل از پروتوپلاست های لقاح شده دارد. این روش برای استفاده در بهنژادی گیاهی برای ایجاد هیبرید با اتحاد سلولهای سوماتیک که درآن گیاه به طریقه دورگ گیری جنسی تلاقی های بین گونه ای تهیه بذرامکان پذیر نباشد، توصیه شده است. هیبریداسیون سلول سوماتیکی فرآیندی چند مرحله ای شامل ایزوله نمودن پروتوپلاست های گونه های مختلف، اتحاد پروتوپلاست های دو گونه مختلف، شناسایی نمودن پروتوپلاست های لقاح یافته هیبریدو باززایی گیاهان هیبرید دور ازپروتوپلاست های لقاح شده می شود. قبل ازاتحاد سلول های گیاهی، حذف دیواره سلولی جهت تولید پروتوپلاست های بدون دیواره ضروری است. سلول های مزوفیل برگ یا سایربافتهای گیاهی، کالوس یاکشت های سوسپانسون سلولی باآنزیمهای هضم کننده دیواره سلولی برای بدست آوردن سوسپانسیون پروتوپلاست ها، تیمار می گردند. برای دورگ نمودن پروتوپلاستهای خالص گونه ها آنها را مخلوط نموده وبه همراه یک عامل آمیخته کننده غالباً پلی اتیلن گلایکول سانتریفوژ می نمایند. تا آنجا مخلوطی ازپروتوپلاست های والدی، پروتوپلاست های آمیخته شده والدی و پروتوپلاست های آمیخته شده هیبریدبوجود می آید. پروتوپلاست های هیبرید به سلول های دارای دیواره و ادامه تقسیم سلولی وادار شده و درنهایت گیاهچه های دارای ریشه و ساقه تولید می گردند. هیبریداسیون سلول سوماتیکی هنگامی به عنوان روشی برای اصلاح کننده نبات درمی آید که تکنیک های متداولی برای کشت پروتوپلاست گونه والدین ایجادگردد. باززایی گیاه از پروتوپلاست های بعضی ازگونه ها مثل سیب زمینی، توتون، یونجه وتعداد اندکی ازگونه های دیگربه راحتی امکان پذیر است درحالی که درغلات وحبوبات به سختی قابل اجرا می باشد. سلول های بین گونه های خویشاوند دور اغلب آنیوپلوئید بوده و به ندرت باززایی شده ودرصورت باززایی شدن گیاهانی عقیم بدست می آید.

روشهای القاء امتزاج :

۱- امتزاج خودبخودی

همانطور که از اسم این روش بر می آید روشی است که در آن امتزاج پروتوپلاستی بدون دخالت دادن هر نوع

ماده امتزاج دهنده یا استفاده از محرک صورت می گیرد. امتزاج خودبخودی برای اولین بار درسال ١٩٠٢ توسط

کاسترتشریح شد. عیب عمده این روش این است که امتزاج به ندرت اتفاق می افتد. به کاربردن امتزاج خود بخودی تولید پروتوپلاست های چند هسته ای درسویا را که هسته های آنها بطور هم زمان تقسیم می شوند امکان پذیر ساخته است. فراوانی اندک امتزاج با این روش مانع از توسعه آن گردیده و لذا تاکید بیشتر برروش های آزمایشی امتزاج که ذیلاً تشریح می شود صورت می گیرد.

2 - روش القاء امتزاج با پلی اتیلن گلیکول (PEG)  

روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج، برای اولین بار توسط کائو در میکالوگ و والین و همکاران (1974) تشریح شده است. PEG یک پلیمرآلی است که با وزنهای مولکولی متفاوت قابل دسترس می باشد. موثرترین دامنه ۱٥٤٠ PEG ، ٤٠٠٠ PEG و٦٠٠٠ PEG می باشد. برای القاء امتزاج با PEG آن را به محیط کشت اضافه می نمایند و دراین ماده مخلوط پروتوپلاست های قابل امتزاج را به حالت سوسپانسیون درمی آورند. معمولاً ازPEG ٣3 – ٢٥% (حجمی/ وزنی) استفاده می شود. باید دقت کرد از مقدار درست و اندازه مولکولی صحیح PEG استفاده کرد. اضافه کردن مقدار زیادی از این ماده باعث انعقاد توده های پروتوپلاست می گردد و اضافه کردن مقدارخیلی کم آن موجب چسبیدن پروتوپلاستها به جای امتزاج می شود. کار با PEG بایستی به دقت مورد ارزیابی قرارگیرد، زیرا این ماده درسلول ها باعث مسمومیت می گردد. بطورمعمول، مخلوط پروتوپلاست را با PEG به مدت ١٠ تا ٣٠ دقیقه درانکوباتورقرار می دهند. بعد از این مدت PEG را می شویند تا از مخلوط حذف گردد. اکثر امتزاج ها درمرحله شستشو صورت می گیرد.

بکار بردن PEG به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج امروزه بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد.

٣ – روش استفاده از کلسیم و PH بالا

این روش شامل قراردادن مخلوط پروتوپلاست در٠٥/٠ مول کلرورکلسیم با PH برابر٥/١٠ در٤/٠ مول مانیتول درون انکوباتور می باشد( Keller and Melchers,1973). پروتوپلاستها را بعدازآن به مدت٣ دقیقه در سرعت پایین سانتریفوژ(g×٥٠) دردرون مخلوط قرارمی دهند. کلروملچرموفقیت درامتزاج ٢٥% پروتوپلاستها راگزارش کرده اند. این روش برای امتزاج پروتوپلاست های مزوفیل برگ وپروتوپلاست های بدست آمده از سلولهای کشت شده مورد استفاده قرارگرفت. پروتوپلاست های امتزاج یافته با مشاهدات چشمی قابل تشخیص هستند .            

٤- استفاده از نیتریت سدیم

اضافه کردن نیتریت سدیم (₅No Na ) به مخلوط پروتوپلاست ها به امتزاج آنها کمک می کند. استفاده از این روش توسط پاورو همکاران(1970) درموقع امتزاج درون گونه ای و بین گونه ای درپروتوپلاست های یولاف و ذرت توسعه یافت. نیتریت سدیم امتزاج بین پروتوپلاست های با سیتوپلاسم زیاد، پروتوپلاست های با
واکوئل کم و پروتوپلاست های ریشه را القاء می کند. به طوری که هرچه پروتوپلاست ها متمایزترباشند

 به همان میزان القاء امتزاج آسان ترخواهد شد .                                                              

٥- روشهای مصون سازی

هارتمن و همکاران(1973) روش مصون سازی القاء امتزاج پروتوپلاست را تشریح کردند. آنها پادتنی را با تزریق عصاره های گیاهی به بدن خرگوش تولید کردند. خرگوش دامنه وسیعی از آنتی بادی را برضد پروتئین های مختلف گیاهی تولید کرد. سپس اثر این پادتن را در امتزاج پروتوپلاست های به دست آمده از Bromus ، سویا و باقلا مورد مطالعه قراردادند این پادتن پس ازامتزاج پروتوپلاست ها باعث اخته شدن گردید. پروتوپلاست های امتزاج یافته قوه نامیه خود را حفظ کرده وحتی تقسیمات سلولی هم درآنها مشاهده گردید .                              

 ٦- امتزاج مکانیکی

میشل و اسچریک(1971) ازروش های فیزیکی نظیر فشارهای مکانیکی القاء امتزاج پروتوپلاست استفاده می کردند. این روش ها به لحاظ راندمان کم آنها درتولید دورگ ها کمتر مورد توجه قرار گرفتند. ولی یکی از محاسن این روش این است که هیچ ماده شیمیایی که ممکن است عوارض جانبی داشته باشد، مثل ایجاد موتاسیون در سلول های کشت شده، دراین جا به کار نمی رود .

٧- امتزاج الکتریکی

اگر پروتوپلاست را در یک محیط کشت سلولی حاوی الکترود قراردهند و به آنها انرژی های پتانسیل مختلف وارد نمایند پروتوپلاست ها بین دوالکترود در یک خط قرار می گیرند(man,1982Zimmer). اگرشخص در این موقع شوک های الکتریکی با موج های مربعی کوتاه وارد نماید می تواند القاء پروتوپلاست را فراهم سازند. این روش به خاطرقابلیت کنترل بالای ذاتی از معروفیت زیادی برخوردار است. درحقیقت امتزاج دو پروتوپلاست با این روش امکان پذیر است.